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477 人阅读发布时间:2024-07-31 13:32
浓缩蛋白质,不造成任何损失使用Amicon® Ultra过滤器进行浓缩,能可靠回收蛋白质。Amicon® 超滤装置可快速、可靠地浓缩蛋白质和生物分子,根据分子量分离分离生物和环境样品中的组分,脱盐和透析蛋白质和抗体,从而进行样品制备。Amicon® Ultra超滤装置采用低结合性的Ultracel® 再生纤维素滤膜,确保更为精准的截留分子量和更高的蛋白回收率。
Amicon®Ultra离心式过滤装置
Amicon® Ultra离心过滤器具有快速超过滤功能,且从稀释液和复杂的样本组合中能达到较高的浓缩系数。其竖式设计以及可用的滤膜表面积使其能进行快速的样本处理,拥有较高的样本回收率,且拥有高达80倍浓缩系数的浓缩能力。
(1)选择合适的超滤管。通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3,比如目的蛋白分子量为35kDa,就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右,则可以用截留分子量3kD的超滤管。认真阅读使用说明书,注意超滤膜对各种化学物质的耐受程度有所不同。
(2)新买来的超滤是干燥的,使用前加入超纯水,水量完全过膜,冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出,即可加入蛋白液,加入的多少,以不超过管顶的白线为准。操作要轻,加入蛋白液前,超滤管需要插在冰上预冷。
(3)平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快,否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤(离心机预冷至4度)。不同离心机的转速 rpm换算成g之后,有所不同。离心机的加速度调至最低档,减小对膜的压力。注意,一定要等离心机达到目的转速之后,方可离开离心机,否则离心机出问题时,无法第一时间处理。膜与转轴的方向根据说明书调整(角转离心机的情况是膜与轴垂直)。在实际使用中,一般转速开的比说明书里的要低,这样可以延长离心管的使用寿命。
(4)当浓缩到剩下1ml时,取50ul缓冲溶液,加入10ul流穿,看有没变蓝色,以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了,将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管,用5mgml的BSA离心10min,再取流穿,跑蛋白胶或Bradford粗测,继续加入剩下的蛋白液浓缩(在冰上操作,防止蛋白受热),直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀,导致堵管。若发生沉淀,要确定沉淀的具体原因,是蛋白浓度过高还是Buffer不合适;前者可用多根超滤管同时超滤,降低浓度的办法解决,后者的方法是换不同的缓冲溶液,直到蛋白不发生沉淀为止。
(5)前面几步用以浓缩蛋白,如果要换Buffer,在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候,轻轻加入新的Buffer(经0.22um超滤膜超滤),再 浓缩至1ml左右,连续三次,最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定,一般不多于500ul,也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算,三次达到1000倍以上,基本上可以达到换buffer的目的。
Amicon® Ultra离心式过滤装置在4种不同体积中提供3 kDa、10 kDa、30 kDa、50 kDa和100 kDa标称分子量限值(NMWL)选择。
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