细胞冻存液(无血清)使用说明

冻存前准备

·仅冻存对数生长期细胞(80%-90%汇合度)，活率需>90%。

·避免使用老化或过度生长的细胞，否则复苏存活率显著降低。

试剂与耗材

·冻存液需提前平衡至室温或4℃备用，禁止反复冻融。

·冻存管密封性需严格检查(管盖内橡胶圈完整)，防止液氮渗入。

·操作全程佩戴手套，DMSO具致癌性且可穿透皮肤。

细胞悬液制备

1.收集细胞:

·贴壁细胞:弃培养基→PBS润洗→胰酶消化(时间依细胞类型定，见细胞变圆脱落即可)→加培养基终止消化一转移至离心管。

·悬浮细胞:直接转移至离心管。

2.离心洗涤:1100rpm离心4-5分钟，弃上清。

3.重悬细胞:

.加入适量冻存液(推荐1-2mL)，轻柔吹打混匀。

·冻存密度:100万-500万/mL(难养细胞建议≥300万/mL)。

·计数验证(可选):取20μL细胞悬液与台盼蓝1:1混合，检测活率。

冻存过程禁忌

1.降温与保存

·无需程序降温:冻存管直接放入-80C冰箱过夜。

·严禁温度波动:-80℃保存≤3个月，长期存储需转移至液氮罐。

·冻存管避免贴壁存放，确保冷空气均匀流通。

2.特殊细胞处理

·干细胞/原代细胞:冻存前需用同款冻存液预实验1周，验证兼容性。

·DMSO敏感细胞:建议同步用含血清冻存液备份，防止意外死亡。

冻存风险规避指南

风险点	解决问题
‌DMSO毒性	全程佩戴防穿透手套，操作台铺设吸水垫
‌细胞复苏成团	重悬时避免气泡，分装前镜检确认单细胞状态
‌管体密封失效	冻存前做浸水测试（37℃水浴10分钟无渗漏）
‌特殊细胞死亡	干细胞/原代细胞冻存前需用同款冻存液预实验1周验证兼容性

 

质控与风险规避

1.复苏验证

·首次冻存24小时后复苏一管，检测活率并保留活细胞备用。

·复苏时需37℃水浴快速解冻(≤2分钟)，立即用培养基稀释洗涤。

2.污染防控

·分装操作需在超净台内完成，冻存液开瓶后严格无菌使用。

·冻存液pH需维持在7.2-7.4，异常pH值影响细胞存活。

复苏质控流程

1.快速解冻:37℃水浴振摇解冻≤90秒，避免冰晶二次形成。

2.DMSO清除:

·解冻后立即加入10倍体积预温培养基稀释。

·离心(800rpm，3分钟)弃上清，重复洗涤1次。

3.活率验证:复苏24小时后检测，活率<80%需排查冻存密度或操作时效。

无血清冻存液核心优势

·免程序降温:直接-80C冷冻，简化流程。

·低污染风险:无动物源成分，避免支原体/病毒污染。

·成分明确性:标准化配方减少批次差异。

附:不同细胞冻存密度参考表

细胞类型	推荐密度 (cells/mL)
肿瘤贴壁细胞	5×10⁶~1×10⁷
杂交瘤细胞	1×10⁶~3×10⁶
人淋巴细胞	≥1×10⁷
干细胞	1×10⁷~2.5×10⁷

 

使用方法：

细胞冻存步骤

1、 常规方法收集对数期的贴壁细胞或者悬浮细胞于试管中。

2、 根据培养细胞的密度和冻存管的大小确定所需冻存的细胞数。

3、 将所需数目的细胞悬浮液置于离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，收集培养细胞沉淀，彻底弃去离心管中的上清液。

4、 加入适量的本冻存液于离心管中，使细胞浓度约为 5*105-1*107/ml。轻柔地混匀细胞，制成细胞混合液。

5、 将离心管中的细胞混合液分装于已标记的冻存管中，建议每管 1ml 或 1.5ml。

6、 直接将分装好的细胞冻存管置于-80℃超低温冰箱中，可长期保存。

7、 若需液氮长期保存，需先置于-80℃至少一天后方可转至液氮罐中。

冻存细胞复苏步骤

1、 从冰箱中取出冻存的细胞，立即置于 37℃水浴槽中快速解冻。

2、 待冻存管中的细胞混合液完全融化后，立即加入 1ml 细胞培养基于冻存管中与细胞混合，将其中的混合液移至含有约 5ml 该细胞培养基的离心管中，1000rpm 离心 5 分钟，收集冻存细胞沉淀，移去上清液（注意勿将细胞沉淀倒掉）。

3、 加入适量的新鲜培养基，使用移液管缓缓加入细胞沉淀中，轻柔混匀，将混匀好的细胞移至事先准备好的培养容器中。

4、镜检观察，待细胞状态恢复后可进行其他研究或者培养处理。

注意事项：

1、 本品可用于常规细胞的冻存，-80℃可长期保存，细胞的存活率在 90-98%。

2、 使用本产品加入细胞后，应尽量减少室温存放时间，并尽快移至-80℃保存。

3、 对于干细胞（ES 细胞）、原代等细胞冻存时，建议使用前，先对所要冻存的细胞进行至少 1 周以上的试验性冻存培养，确认效果后再正式大批量冻存。

4、 本品含有 10%DMSO，部分对 DMSO 敏感的细胞，建议先进行预实验，确认效果后再大量正式使用。

5、 对于没有保种的新的细胞类型，使用本品时建议冻存部分细胞于含血清的冻存液中，以避免可能的意外情况。

6、 取用冻存液均要在超净工作台内无菌操作 。

7、 为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

保存条件：

常温运输，短期 4℃保存，有效期一年；长期-20℃保存，有效期两年。

产品简介：

本品含有 DMSO、葡萄糖等各种细胞营养成分，适用于各种常见和肿瘤动物细胞株，冻存的细胞可在-80℃长期保存，无需经过程序性降温过程。

本品的配方成分明确，不含有动物来源的蛋白，不含血清，可减少各类细菌、病毒和支原体等污染，保证冻存细胞的安全，且适合无血清培养细胞和蛋白表达细胞。

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