PCR的基本反应步骤是什么

聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA（或RNA）片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。因此，无论是化石中的古生物、历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对。这也是“微量证据”的威力之所在。

1、引物的设计：

引物需要自己查找文献或者自己设计，然后交给合适的生物公司来帮我们合成，合成引物，每管装1OD。拿到引物后需要加水溶解，但是因为引物是看不见的，所以为了防止溶解过程中引物的丢失，拿到引物后最好先高速离心（10000rpm, 4°C离心2min）再进行加水溶解（ddH2O）。

水的体积按引物浓度稀释100倍，溶解好的引物用小管分装，每管装50μl即可，分装后放-20°C保存。

 

2、制作模板：

模板的制作可以直接借助试剂盒，一般情况下Trizol的试剂可以完全满足需要，直接按照试剂盒提示来做就可以了。

 

3、建立体系、上机：

PCR需要用到的DNA聚合酶、buffer、dNTPs。而经常用的DNA聚合酶有Taq酶，买的同时会附送10×buffer(主要成分是KCl、Tris-HCl和MgCl2，有些还有(NH4)2SO4)。

做PCR之前要提醒大家一点，不是所有的PCR都用同样的反应体系的，也就是说PCR体系里用到的试剂除了10×Taq Buffer以外，其它其实都是需要摸条件的，但是按大多数情况来说，需要调整的并不多，可能需要调整的主要试剂是MgCl2（其实是要调整Mg2+的浓度）；可能需要控制的条件主要是退火温度。

 

4、跑胶验证：

在电泳之前，需要进行凝胶的配制，凝胶液配制的过程并不复杂，先用天平称取适量的琼脂糖粉末，加入到一定体积的1×TAE（Tris、乙酸、EDTA）缓冲液中，微波炉加热至沸腾，拿出来摇匀，帮助粉末溶解，反复沸腾多次直到粉末完全溶解。待溶液不烫手，将核酸染料加入溶液中摇匀，接着将溶液趁热倒到做胶的凝胶板上，插上梳子（用来预留加样孔），等半小时左右胶凝固拔下梳子，连胶带板一起放到电泳槽中，加电泳液至完全淹没整块凝胶（电泳槽中的电泳液也用1×TAE缓冲液）。

然后将loading buffer与样品混合，加入到凝胶小空（“梳子”形成的洞）中，DNA maker作为对照，同样加入到筛孔中，然后插上电源开始跑胶就可以了，凝胶上有颜色的有两条带，等到前面的蓝色带跑到整块胶的2/3处停止电泳（断电），然后把胶拿出来，放到紫外光下观察条。

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