Trizol试剂的标准操作步骤

结合Trizol试剂的理化特性与提取原理，其标准化操作流程可分为样本裂解、相分离、核酸与蛋白沉淀、洗涤溶解四大核心步骤，全程遵循低温、无酶、无污染操作原则，可稳定提取高质量总RNA、DNA及蛋白质，具体操作流程如下：

1. 样本裂解均质化

根据样本类型精准配比试剂用量，常规每1 mL Trizol试剂可处理50–100 mg组织样本或1×10⁷个细胞样本。若是贴壁细胞，直接弃去培养基，用PBS轻柔清洗1–2次去除残留培养基，加入对应体积Trizol试剂，反复吹打至细胞完全裂解脱落；若是悬浮细胞，离心收集细胞沉淀后弃上清，加入Trizol试剂充分吹打裂解；若是动植物组织样本，需提前低温研磨，加入Trizol试剂后冰上充分匀浆，保证组织完全破碎。裂解完成后，将混合液室温静置5 min，彻底解离核蛋白复合物，保证生物大分子充分释放。

2. 分层相分离

向裂解液中按照Trizol:=1:0.2的比例加入，剧烈震荡混匀15–30 s，使溶液充分乳化，室温静置2–3 min。随后将样本置于低温高速离心机中，4℃、12000 rpm离心15 min。离心后溶液会清晰分为三层：上层无色水相、中间白色蛋白层、下层粉色有机相，其中总RNA留存于水相，DNA与蛋白质分布于中间层与有机相。轻柔取出离心管，避免晃动造成相层混杂，小心吸取上层水相转移至新的无酶离心管中，用于后续RNA提取，剩余液相可留存用于DNA和蛋白提取。

3. 异丙醇沉淀生物大分子

针对RNA提取：向吸取的水相溶液中加入等体积预冷异丙醇，轻柔颠倒混匀，室温静置10 min或-20℃静置30 min，充分沉淀RNA。随后4℃、12000 rpm离心10 min，管底可见白色微量RNA沉淀，小心弃去上清，避免触碰沉淀。

针对DNA与蛋白提取：剩余的中间层与有机相，可分别通过专用沉淀试剂处理，水相用于RNA、中间层经乙醇沉淀可得基因组DNA，有机相经异丙醇沉淀可提取样本总蛋白，实现一份样本多组分同步获取。

4. 洗涤、干燥与溶解

向RNA沉淀管中加入预冷的75%无水乙醇（无酶水配制），轻柔吹打洗涤沉淀，去除残留盐离子、蛋白及有机溶剂杂质，4℃、7500 rpm离心5 min，弃去上清，重复洗涤1–2次。洗涤完成后，室温倒置干燥或真空短暂干燥沉淀，严格避免过度干燥导致RNA难溶、降解。最后根据沉淀量加入适量无酶纯水，轻柔吹打充分溶解RNA沉淀，获得高纯度总RNA产物，可直接用于后续分子实验或-80℃低温保存。

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