CCK-8试剂盒细胞增殖-毒性检测试剂盒使用说明

一、实验关键优化点

1.细胞铺板

·悬液混匀:吹吸≥10次消除团块，接种时枪头斜贴孔壁缓慢加样，避免冲击细胞。

·边缘孔处理:96孔板最外圈孔加PBS缓冲液防蒸发，不作为检测孔。

·接种密度(96孔板标准):

·贴壁细胞:增殖实验1000-2000个/孔，毒性实验5000-10000个/孔;

·白细胞:≥2500个/孔。

2.加药操作

·吸弃旧培养基后，沿孔壁缓慢加入含药培养基，避免气泡产生。

·氧化/还原性药物(如维生素C):需更换新鲜培养基并洗涤细胞2次后再加CCK-8，防止假阳性/阴性。

3.显色控制

·CCK-8添加量:终浓度10%(如100ul培养基加10μl试剂)。

·孵育时间:37℃避光1-4小时，每30分钟测OD值至0.8-1.5(最佳线性区间)45。

·混匀:加试剂后轻敲板侧壁混匀，禁止震摇(防细胞脱落)。

实验原理

 

1.反应机制:

WST-8(水溶性四唑盐)在电子载体1-甲氧基PMS存在下，被活细胞线粒体脱氢酶还原为水溶性甲臜，颜色深度与活细胞数量正相关34。

2.应用范围:

用于药物筛选、细胞增殖/毒性分析、肿瘤药敏试验等，通过OD值反映细胞活性(增殖时OD值升高，毒性作用时降低)34。

 

自备耗材

·酶标仪(能测 450 nm处的吸光值)及二氧化碳培养箱(37℃，5% CO₂)

·96孔细胞培养板，透明平底、可调节式移液枪及枪头

 

试剂准备

CCK-8溶液:即用型，无需预混合组分。

实验流程和操作步骤

 

实验流程

细胞计数方案

1.在96孔板中接种细胞悬液(100μL/孔)，将板在潮湿的培养箱中预先培养(37℃，5% CO₂);

2.在平板的每个孔中加入10μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰OD值读取;

3.在培养箱中将平板孵育1-4h;时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定;

4.使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

 

细胞增殖/毒性检测方案

1.在96孔板中接种100μL细胞悬液(5,000个细胞/孔)，将板在潮湿的培养箱中预培养24h(37℃，5% CO₂);

2.在平板中加入1-10μL各种浓度的待测物质;

3.在培养箱中将平板孵育适当的时间(例如6、12、24或48 h);

4.向板的每个孔中加入10 μL CCK-8溶液，注意不要将气泡引入孔中，因为它们会干扰OD值读取;

5.在培养箱中将平板孵育1-4h;时间的长短根据细胞的类型和细胞的密度等实验情况而定;

6.使用酶标仪测量450nm处的吸光度。

操作步骤

1、在96孔板中接种细胞悬液(100ul/孔),通常细胞增殖实验每孔约2000个细胞，细胞毒性实验每孔约5000个细胞，具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等因素决定)。

2、按照实验需要，进行培养并给予0-10u1特定的药物刺激，处理一段适当的时间(例如：6,12,24或48小时)。

3、每孔加入10ul CCK-8溶液。如果起始的培养体积为200u1,则需加入20ul CCK-8溶液，以此类推。可以用加相应量细胞培养基和CCK-8但不加细胞的孔作为空白对照，若担心所使用的药物会干扰检测，需设置加相应量细胞培养液、药物和CCK-8溶液但不加细胞的孔作为空白对照。

4、在细胞培养箱内继续孵育1-4小时，具体时间可以通过预实验确定。预实验时可以在0.5、1、2和4小时后分别用酶标仪检测，然后选取吸光度范围比较适宜的一个时间点用于后续实验。

5、用酶标仪测定在450nm处的吸光值，若无450nm滤光片，可以使用420-480mm的滤光片。如果样品为高浑浊度的细胞悬液，可以使用大于600nm的波长，例如650nm,作为参考波长进行双波长测定。

6、如果需要暂时不测定OD值，可以向每孔中加入10ul0.1MHCI溶液或者1%w/v的SDS溶液，避光保存在室温，24小时内吸光度不会发生变化。

 

实验步骤注意事项：

1、‌细胞接种与预培养‌。

· 将细胞消化后重悬为单细胞悬液，调整浓度至约5×10³~5×10⁴个/ml（具体根据细胞类型调整）。

· 在96孔板中每孔加入100μl细胞悬液（设置3~6个复孔），并围绕孔边加入PBS以减少蒸发影响。‌‌‌‌

· 将培养板置于37℃、5% CO₂培养箱中预培养24小时（贴壁细胞）或悬浮细胞直接培养至对数生长期。

2、‌药物处理‌。

· 弃去原培养基，向实验组孔中加入含不同浓度药物的培养基（如抗癌药物或毒性物质），对照组仅加基础培养基。

· 继续孵育一定时间（如24小时），使药物充分作用。

3、‌CCK-8试剂添加与孵育‌。

· 弃去原培养基，每孔加入10μl CCK-8溶液（或用基础培养基稀释至含10% CCK-8），轻轻晃动培养板确保试剂均匀分布。

· 将培养板重新放入培养箱中孵育1~4小时（根据颜色变化调整时间），避免气泡产生影响吸光值测定。

4、‌吸光度测定与数据分析‌。

· 使用酶标仪在450nm波长下测定各孔的吸光度（As、Ac、Ab分别代表实验组、对照组和空白组的吸光度）。‌‌

· 计算细胞存活率或抑制率：

· 剔除异常数据后取平均值进行分析。‌‌

 

实验结果分析：

细胞活力=[OD(加药)-OD(空白)]/[OD(0加药)-OD(空白)]×100%

抑制率=[OD(0加药)-OD(加药)]/[OD(0加药)-OD(空白)]×100%OD(加药):具有细胞、培养基、CCK-8溶液和药物溶液的孔的吸光值

OD(空白):具有培养基、CCK-8溶液，没有细胞的孔的吸光值

OD(0加药):具有细胞、培养基、CCK-8溶液，没有药物溶液的孔的吸光值

 

注意事项：

1、使用96孔板进行检测时，如果细胞培养时间较长，请注意蒸发问题。可将96孔板外围一圈加培养基、水或PBS保湿。同时，可以把96孔板置于培养箱内靠近水盘的位置以缓解蒸发。

2、培养时间根据细胞种类的不同和每孔内细胞数量的多少而不同。在正式实验前，建议先做预实验摸索铺板的细胞数量以及加入CCK-8试剂后的培养时间。

3、铺板时请注意保证每个孔细胞数量均匀，建议铺板过程中注意时常混匀，防止因细胞沉淀造成不均匀。加入CCK-8后请前后左右轻轻晃动培养板数次，使培养基和CCK-8溶液充分混匀。

4、本试剂盒的检测依赖于脱氢酶催化的反应，如果待测物质有氧化性或还原性，可在加CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉药物的影响。若药物影响比较小的情况可以不更换培养基，直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。

5、加入CCK-8时，如果细胞培养时间较长，培养基颜色或pH值已变化，建议换用新

鲜的培养基。

6、用酶标仪检测前需确保每个孔内没有气泡，否则会干扰测定。

7、本试剂盒系无菌灌装生产。在使用过程中，请在生物安全柜内无菌操作，避免污染。

8、为了您的健康和安全，请穿着实验服并戴一次性手套或乳胶手套操作。

 

产品简介：

CCK-8试剂盒，是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂临。WST-8是一种类似于MTT的化合物，在电子耦合试剂1-MethoxyPMS存在的情况下，可以被还原生成橙黄色水溶性的甲攒(Formazan)。细胞增殖越多越快，则颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅。对于同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。

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